Metode Uji Kemurnian Bakteri

Uji kemurnian bakteri yang dilakukan meliputi uji morfologi sel menggunakan pengecatan Gram, uji morfologi koloni bakteri, uji motilitas dan sifat bakteri terhadap udara, dan uji biokimia. Uji biokimia terdiri dari uji fermentasi karbohidrat menggunakan glukosa, laktosa, dan sukrosa, uji reduksi nitrat, serta uji katalase.

Pewarnaan Gram merupakan salah satu pewarnaan diferensial dan prosedur yang penting dalam identifikasi bakteri. Pewarnaan Gram dapat membedakan bakteri menjadi 2 kelompok, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif. Perbedaan ini dapat terjadi karena adanya perbedaan komposisi dinding sel bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang lebih tebal namun akan menyusut ketika diberi larutan alkohol (larutan Gram C) karena terjadi dehidrasi, sehingga pori-pori dinding selnya menutup dan mencegah zat warna ungu dari larutan violet (larutan Gram A) terlarut. Komposisi sel bakteri Gram negatif berbeda, yaitu dinding selnya memiliki kandungan lipid yang lebih tinggi dan lipid tersebut dapat larut dalam alkohol (larutan Gram C). Larutnya lipid oleh alkohol diduga sebagai penyebab pori-pori dinding sel menjadi lebih besar dan menyebabkan warna merah dari larutan safranin (larutan Gram D) dapat terikat pada dinding sel (Madigan dkk., 2012).

Uji morfologi koloni bakteri (MKB) menggunakan metode streak plate di medium Nutrient Agar (NA) petri dengan tujuan untuk mendapatkan koloni tunggal bakteri yang terpisah, sehingga mempermudah pengamatan morfologi koloninya (Nurdyanto dan Zubaidah, 2015).

Uji nitrat dilakukan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam mereduksi nitrat menjadi nitrit (Hasanah dkk., 2012). Uji nitrat menggunakan medium NB yang diberi tambahan nitrat. Bakteri uji diinokulasikan ke dalam medium, diinkubasi, kemudian diuji menggunakan reagen sulfanilic acid (SA) dan n-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride (NED).

Bakteri yang memiliki enzim nitrat reduktase akan mampu mereduksi nitrat menjadi nitrit. Nitrat yang telah tereduksi menjadi nitrit akan bereaksi dengan reagen SA dan NED membentuk senyawa azo berwarna merah keunguan (Jeffery dkk., 1989). Reaksi nitrit dengan reagen uji dapat dilihat pada Gambar 1

Uji katalase merupakan uji yang biasanya dilakukan pada bakteri berbentuk kokus dengan tujuan untuk membedakan antara Staphylococcus dan Streptococcus, dimana kelompok Staphylococcus bersifat katalase positif dan kelompok Streptococcus bersifat katalase negatif. Katalase merupakan enzim yang mengkatalisa penguraian hidrogen peroksida (H2O2) menjadi air (H2O) dan oksigen (O2) (Dewi, 2013). Uji katalase dilakukan dengan cara mengoleskan bakteri uji pada gelas benda, kemudian ditetesi dengan H2O2. Reaksi positif uji katalase ditunjukkan dengan terbentuknya gelembung- gelembung udara (Dewi, 2013). Reaksi kimiawi yang dikatalisasikan oleh enzim katalase dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 6. Reaksi uji katalase (Sumber: Dewi, 2013)

Keterangan: Enzim katalase akan mengkatalisa penguraian H2O2 (hidrogen peroksida) menjadi air dan oksigen (gelembung udara)

Deskripsi dan Golongan Antibakteri

Antibakteri adalah zat yang dapat mengganggu pertumbuhan dan metabolisme bakteri yang merugikan manusia (Pelczar dan Chan, 1986). Antibakteri yang ideal harus memiliki sifat toksisitas selektif setinggi mungkin, artinya obat tersebut harus bersifat sangat toksik untuk mikrobia tetapi relatif tidak toksik untuk inang atau manusia (Kharismayanti, 2015). Menurut Madigan dkk. (2015), antibakteri dapat dibedakan menjadi tiga golongan, yaitu:

1. Bakteriostatik, merupakan antibakteri yang mampu menghambat proses biokimia penting, seperti sintesis protein, karena senyawa antibakteri dapat berikatan lemah dengan target seluler (ribosom), sehingga jika senyawa antibakteri dihilangkan maka pertumbuhan bakteri dapat berlanjut
2. Bakterisidal, merupakan antibakteri yang berikatan kuat dengan target seluler (ribosom) sehingga mampu membunuh bakteri tanpa melisiskan sel bakteri
3. Bakteriolitik, merupakan antibakteri yang memiliki kemampuan membunuh bakteri dengan cara melisiskan atau memecahkan selnya, sehingga isi sitoplasmanya keluar dari sel. Antibakteri akan menghambat sintesis dinding sel bakteri dengan menghambat enzim bakteri yang diperlukan untuk pemecahan sel dan sintesis seluler, sehingga bakteri akan mati akibat lisis sel (Kee dan Hayes, 1994).

Parameter dan Metode Uji Antibakteri

Menurut Pratiwi (2008), metode uji antibakteri dibagi menjadi dua macam, antara lain metode difusi dan dilusi. Metode difusi digunakan untuk menentukan aktivitas antibakteri suatu agen antimikrobia. Aktivitas antibakteri tersebut ditandai dengan terbentuknya area jernih pada permukaan medium agar. Metode difusi dibedakan menjadi dua, yaitu metode cakram Kirby Bauer (difusi disk) dan metode sumuran.

Metode cakram Kirby Bauer atau metode difusi disk dilakukan dengan cara menginokulasikan biakan pada permukaan medium agar, kemudian senyawa antibakteri diletakkan dalam medium agar yang mengandung organisme yang diuji. Senyawa antibakteri akan berdifusi ke medium agar dan efektivitasnya ditunjukkan oleh zona hambatan. Zona hambatan tampak sebagai area jernih atau bersih yang mengelilingi tempat senyawa antibakteri terdifusi. Metode sumuran merupakan metode yang serupa dengan metode difusi disk, tetapi dibuat sumur pada medium agar yang telah ditanami biakan dan pada sumur diisi senyawa antibakteri yang akan diuji (Pratiwi, 2008).

Metode dilusi digunakan untuk mengukur konsentrasi hambat minimum (KHM), yaitu konsentrasi senyawa antibakteri terendah yang masih dapat menghambat pertumbuhan organisme tertentu (Harmita dan Radji, 2006). Metode ini dilakukan dengan membuat seri pengenceran senyawa antibakteri pada medium cair. Inokulum mikroorganisme ditambahkan ke dalam tabung yang mengandung seri pengenceran suatu senyawa antibakteri dan pertumbuhannya akan diamati melalui perubahan kekeruhan. Prosedur ini digunakan untuk menentukan konsentrasi senyawa antibakteri yang masih efektif untuk mencegah pertumbuhan patogen. Metode dilusi ini dapat dilanjutkan dengan cara menginokulasikan senyawa antibakteri tersebut ke medium agar petri, sehingga jumlah koloni bakteri yang tumbuh dapat dihitung (Madigan dkk., 2012).